الرئيسية / زراعي / استخدام طرق زراعة الانسجة في تربية النبات

استخدام طرق زراعة الانسجة في تربية النبات

ان طريقة زراعة الانسجة قد اعانت مربي النباتات واختصرت سبل انتاج نباتات واصناف جديدة وخاصة في بعض النباتات مثل محاصيل الزينة والخضر وبعض انواع الحبوب، فمن المعروف انه باستخدام طرق التربية التقليدية المتبعة حاليا يتم انتاج صنف جديد خلال، بينها باستخدام زراعة الانسجة يمكن اختصار هذا الزمن الى النصف ويتم ذلك بعدة طرق اهمها:

1 – استخدام طرق زراعة المتوك anthers وحبوب اللقاح polleng grains لإنتاج نباتات تحمل العدد النصفي من الكروموسومات (1N) لإنتاج نباتات نقية تدخل في برامج التربية اختصارا للوقت.

2 – انتاج الهجن للتغلب على مشاكل العقم في بعض الاصناف.

3 – زراعة الاجنة النيوسيلية لإنتاج نباتات مشابهة للإباء.

4 – انتاج طفرات وراثية بتعريض الانسجة الى مواد مطفرة اما كيماوية او بالإشعاع ثم الانتقاء لما هو مفيد.

5 – استخدام طريقة protoplast fusion لإنتاج هجن جديدة.

6 – زراعة وانقاذ الاجنةembryo rescue .

7 – البذور الصناعية artificial seeds (synthetic seeds)

8 – نقل صفات وراثية محددة خلال ما يعرف بالهندسة الوراثية.

 

زراعة المتوك

 

يقوم مربي النبات خلال برامج التربية التقليدية بالحصول على نباتات احادية المجموعة الكروموسومية (N) وتستغرق هذه الطريقة للحصول على صنف نقى عدة سنوات ومجهود مضن ووقت طويل بالإضافة الى التكلفة المادية. ولكن عند استخدام تقنية زراعة المتوك او حبوب اللقاح يؤدي ذلك الى انتاج نباتات احادية المجموعة الكروموسومية بطريقة سريعة وسهلة ولا تحتاج الى امكانيات كبيرة عند تطبيقها وذلك بالمقارنة مع الطرق التقليدية التي يتبعها مربي النبات. وقد تم الاستفادة من هذه التقنية في العديد من الاصناف النباتية مثل: الارز والقمح والدخان والقطن وفول الصويا وغيرها من النباتات

(Gresshoff، 1972، Chu، 1978،Collins، and Genovesi 1982)

والهدف النهائي لتطبيق هذه الطريقة هو الحصول على نباتات نقية homozygous والتي تدخل بدورها في برامج التحسين الوراثي ويمكن ايضا الحصول على قوة الهجين من خلالها.

ومن الناحية التاريخية يجب ان نذكر البحوث التي قدمها كل من العلماء

Niitsch and، Nitsch، 1969; Guha and Maheshwari1964

في ارساء هذه التقنية الهامة. وتتميز طرق زراعة المتك في المعمل ببساطتها وكفاءتها العالية في انتاج نباتات احادية وبالطبع هذه النباتات تختلف عن النباتات الاصلية وراثيا ومظهريا عن نباتات الام التي تم فصل النسيج منها. وهنا يجب ان نذكر ان المتك يتكون من نوعين من الانسجة، النسيج الاول هو الغلاف وتركيب خلاياه يحتوي على مجموعة متضاعفة من الكروموسومات (2N) وهي متشابهة للخلايا الجسمية الأخرى المكونة للنبات الام، اما حبوب اللقاح pollen grains الموجودة داخل الغلاف فهي احادية المجموعة الكروموسومية (1N).

تتكون الاجنة الذكرية بطريقة مباشرة direct embryogenesis حيث تنتج اجنة احادية العدد الكروموسومي مباشرة من حبوب اللقاح بدون الدخول في مرحلة تكوين الكالوس وبعد عدة اسابيع تظهر الاجنة في صورة نموات صغيرة تتكشف عن نباتات احادية العدد الكروموسومي.

وقد تنشا بطريقة غير مباشرة indirect embryogenesis حيث يتكون كالوس احادي العدد الكروموسومي من حبوب اللقاح وذلك بكمية قليلة جدا ثم يتكشف الكالوس الى اجنة احادية ينتج عنه نباتات احادية. ومن الجدير بالذكر انه يمكن انتاج نباتات ذات عدد زوجي من الكروموسومات خلال مضاعفة العدد الكروموسومي باستخدام مواد كيميائية مثل الكولشسين (cholchicine).

تستخدم عدة بيئات لزراعة المتك منها (White .1963 and Nitsch and Nitsch1969) الا انه يمكن عمل اجراء تعديل لهذه البيئات حسب نوع النبات المستخدم فمثلا تركيز السكر قد يزداد قليلا في حالة متك الذرة عن استخدام متك القمح وان وجود الفحم النباتي النشط قد يؤدي في بعض الاحيان الى انتاج اعداد وفيرة من النباتات لقدرته على ادمصاص المركبات السامة المثبطة للنمو التي قد يفرزها المتك. كما ان الفحم النباتي يقوم بتنظيم امتصاص منظمات النمو الداخلية في النسيج والخارجية التي تضاف الى البيئة.

هناك عوامل تؤثر على تكوين الاجنة الذكرية منها عمر النبات والمرحلة الفسيولوجية المتك المفصولة من نباتات حديثة العمر وفي بداية موسم التزهير تكون مناسبة اكثر من المتك المفصولة من نباتات متقدمة في العمر.

من اهم المعاملات ما قبل الزراعة والتي تشجع على embryogenesis هي تعريض البراعم الزهرية المحتوية على المتوك الى درجة حرارة منخفضة (3-5م) لمدة لا تتعدى 72 ساعة وذلك قبل استعمال البراعم في الزراعة. كما ان حفظ الزراعات في بعض الاحيان في الظلام لفترة معينة او حتى في الضوء الخافت يساعد ذلك على زيادة عدد الاجنة المتكونة وقد لوحظ ايضا ان اضافة الفحم النباتي الى بيئة المتوك لنبات الدخان ادى الى زيادة في عدد الاجنة من 15–45 ٪ في بعض الاصناف وقد وصل الى 90 ٪ في اصناف اخرى وايضا ادى الى سرعة نموها(Gresshoff، 1972 and Chu، 1978) .

 

خطوات انتاج نباتات احادية المجموعة الكروموسومية – زراعة المتوك

 

1- اختيار البراعم الزهرية في بداية موسم الازهار والمعاملة بدرجة الحرارة المنخفضة.

2 – فصل المتوك من البرعم الزهري.

3 – زراعه المتوك على بيئة ملائمة.

4 – يحدث تكشف للأنسجة المزروعة.

5 – تكشف مباشر حيث يبدا في الظهور اجنه جسمية ثم تطورها الى نباتات صغيرة احادية المجموعة الكروموسوميهN.

6 – تفصل هذه النباتات الصغيرة وتنقل الى بيئة جديدة.

7 – تعامل النباتات بمادة الكولشسين للحصول على نباتات ثنائية المجموعة الكروموسومية 2N.

8 – تكشف غير مباشر حيث يبدا في الظهور نسيج الكالوس وتضخمه ليتكشف عنه نباتات صغيرة.

9 – تفصل هذه النباتات الصغيرة وتنقل الى بيئة جديد.

10 – تعامل النباتات بمادة الكولشسين للحصول على نباتات نقية ثنائية المجموعة الكروموسومية 2N.

 

انتاج سلالات منتخبة

 

سوف نذكر هنا كيفية الاستفادة من تطبيقات زراعة الانسجة في انتاج سلالات منتخبة جديدة من النباتات. فمن المعروف تقليديا انه يتم زراعة نباتات الجربيرا عن طريق البذور في برامج التربية وهنا يتم انتاج نباتات مختلفة نظرا لما يحدث من انعزالات تؤدي الى انتاج ازهار متباينة الالوان وهنا يمكن لمربي النبات ان يختار لون الزهرة المطلوبة او المميزة ويتم اكثار النبات عن طريق القمم النامية او البراعم الجانبية باستخدام زراعة الانسجة للمحافظة على لون وصفات الزهرة اي تكاثر خضري. كما انه من المعروف عند اجراء التهجينات بين اصناف هذه النباتات فان معدل نجاح انتاج البذور ضئيل وقد تنتج بذرة واحدة في قرص الزهرة مما يؤدي الى انتاج نبات واحد هجين وهنا ايضا يمكن اكثاره بالزراعة النسيجية. وخلال هذه الطرق يمكن انتاج عدة ملايين من النبات الجديد خلال عام واحد.

وعلى العموم فان اختيار نباتات فردية ثم انتاج نويات من هذه النباتات الفردية فهي طريقة تسرع من برامج التربية وتعطي المربى وسائل غير تقليدية في التحسين السريع للأصناف النباتية (Murashige et al.، 1974، Day 1980، Kucherenko، 1985)

ان فكرة ان الخلايا المنزرعة معمليا in vitro يمكن استخدامها كوحدات للانتقاء او الاختيار منها على اساس المقاومة للأمراض او ذات صفات مختلفة تعتبر اكثر نجاحا من اختيار النبات الكامل، هذه الفكرة تعتمد على حدوث طفرات محدثة او ذاتية Spontaneous في المعمل ثم بعد ذلك يتم اختيار الخلايا المقاومة والتي تكون تحت تأثير العامل المطفر، بعد ذلك يتم الحصول على النباتات من تلك الخلايا وحدوث تكشف ونمو للخلايا المقاومة الى نباتات كاملة (1985،Kucherenko).

الا ان هذه النباتات الناتجة ليس من الضرورة ان تحافظ على قدرتها على التحمل او المقاومة عند نقل النباتات الى الحقل ومن المحتمل حدوث ارتداد الى الاصل عندما تكون هذه التغيرات غير ثابتة وراثيا وبالتالي لا يتم انتقالها خلال الاجيال المتعاقبة.

 

زراعة وانقاذ الاجنة

 

ان تقنية زراعة وانقاذ الجنين هي واحدة من بين الاساليب المعملية او مزارع الانسجة المستخدمة مع بعض الانواع النباتية. وهي تشير الى عدد من التقنيات التي تدعم نمو جنين غير ناضج او ضعيف ليكون نباتا قادر علي النمو. تستخدم هذه الاساليب عادة لإنتاج نباتات من الهجن التي تعطي بذورا غير حية.

ولكي يتم انقاذ الجنين لابد من بدء الزراعة قبل موته. يعتمد على نوع البيئة وعلى مرحلة نمو الجنين. تحتاج الاجنة الصغيرة الى بيئة معقدة ذات تركيزات عالية من السكروز، بينما يمكن للأجنة الاكثر نضجا ان تنمو عادة في بيئة بسيطة ذات سكروز بمستوي اقل.

في المعهد الدولي لبحوث المحاصيل للمداريات شبه الجافة (ICRISAT)، استخدمت هذه التقنية لتحسين اصناف من الفول والحمص حيث تم تطوير نوعية هجين من الفول (ICPH8)  هذه النوعية مقاومة ايضا لمسببات الامراض والحشرات.

من المشاكل التي تواجه برامج تربية اشجار الفاكهة هي العقم الكامل او الجزئي لأعضاء التناسل في الازهار وعدم التوافق الذاتي او الخلطي وعدم التوافق ما بعد تكوين الزيجوت. الا ان اجهاض جنين الهجين لا يعنى انها غير حية. يمكن احياء الهجن بعزل الجنين وزراعته في بيئة ملائمة في تقنيات انقاذ الجنين معمليا. لقد تم الحصول على عديد من هجين النباتات ذات النواة الحجرية النوع خلال برنامج كما في  P. salicina، P. spinosaو P.domestica L. وايضا كما في برنامج هجين Prunus avium هناك صعوبة في انتاج بعض الهجن بالطريقة التقليدية فمثلا اذا تم تلقيح نوعين مختلفين من الشعير وهما H. vulgare X H.bulbosum يعطي هجينا عقيما نظرا لفشل الاندوسبيرم في النمو اثناء تلقيح البويضة وبالتالي يفشل الجنين في التكون لإنتاج بذرة خصبة يمكن انباتها. الا انه عند عزل الجنين غير الناضج وزراعته على بيئة صناعية ملائمة وكبديل للاندوسبيرم فغالبا ما يؤدي ذلك الى انتاج نبات هجين. ومن هذا نرى انه يمكن بهذه الوسيلة ادخال عديد من الصفات لإنتاج كثير من النباتات والطرز الجديدة. وقد استخدمت هذه الطريقة ايضا في ادخال صفة المقاومة من الاصناف البرية من الطماطم  Lycopersicom peruvianum الى الطماطم التي تستخدم في الاكل وذلك بغرض مقاومتها لاحد الفطريات Fulvia fulva حيث تم التهجين مع انقاذ الجنين 1980.Misic et al.

يعتبر شجر النبق أو السدر كما ذكر في الكتب السماوية أحد محاصيل الفاكهة النادرة والمتحملة للجفاف كما أن للثمار فوائد طبية وتنتشر في مصر والوطن العربي كأشجار متناثرة في الحقول وفي مصر تتركز في محافظات الوجه القبلي. وفي الخمسينيات من القرن الماضي ظهرت طفرة برعميه في النبق في محافظة أسيوط أطلق عليها “نبق حزين” والتي لاقت أهمية كبيرة نظراً لكبر حجم الثمار وزيادة اللب وصغر حجم البذور. وتواجه أشجار “نبق حزين” مشكلة عدم إنبات البذور ويتم الإكثار عن طريق التطعيم فقط وهي طريقة تقليدية بطيئة للإكثار.

أجريت دراسات على جنين بذور هذا الصنف في جامعة أسيوط باستخلاص الأجنة غير الناضجة من بذور الثمار وبعد الأسبوع الثامن عشر من العقد حيث نجحت في الإنبات على بيئة MS والتي تحتوي على 5 ملليجرام BA.

أكدت الدراسات التشريحية للبذور أنها رفيعة وضيقة جدا والقصرة سميكة وصلبة أما الجنين فصغير كما أن الفلقتين كبيرتان في الحجم وتحتل معظم مساحة البذرة ويجعلها تشكل ضغطا كبيرا على الجنين مما يؤدي إلى إجهاضه. وتعتبر هذه الدراسات من الأهمية بمكان لإنقاذ جنين صنف النبق حزين باستخدام إحدى تقنيات زراعة الأنسجة والمفيدة في العديد من برامج التربية للأصناف (El-Agamy et al.، 2004 and Abo-Elella، 2008)

 

الاندماج الخلوي (دمج البروتوبلاست) protoplast fusion

 

يعتبر التلقيح بين الأصناف من أهم التقنيات التقليدية التي اتبعت خلال القرن العشرين حيث أمكن الحصول على أصناف هجن متميزة في عديد من المحاصيل ولعلنا نذكر الثورة الخضراء التي قادها العالم نورمان برلوج خلال السبعينيات من القرن الماضي والتي اعتمدت على قوانين مندل للوراثة وكان تطبيقها في نباتات الحبوب مثل القمح والذرة والتي استغل فيها الأصناف البرية للحصول على بعض الصفات ونقلها للأصناف الزراعية لها أثر كبير في النهوض بإنتاجيتها.

وفيها يتم نقل عوامل الوراثة من نبات إلى آخر باستخدام التلقيح والإخصاب وإنتاج ما يسمى بالزيجوت الذى يحمل الصفات الوراثية نصفها من الأم والأخرى من الأب لينتج فرداً جديداً بصفات مشتركة وبالتالي أصناف جديدة إلا أنه هناك بعض النباتات التي يصعب تهجينها بالطريقة التقليدية لأسباب عديدة منها عدم وجود قرابة بين هذه النباتات أو عدم التوافق أو وجود عقم ذكري أو غير ذلك.

إن البروتوبلاست protoplast عبارة عن خلية نباتية إما أن تكون خلية جسمية (2N) أو خلية جنسية (1N) بعد هضم الجدار الخلوي السليولوزي الأصل باستخدام إنزيمات هضم السليولوز وينتج عن ذلك خلية يحدها من الخارج غشاء رقيق وتتحول إلى خلايا كروية الشكلي منفردة (انظر الشكل التالي) (2005 ،Davey et al).

 

خلايا البروتوبلاست تحت المجهر الضوئي

 

ويقصد بدمج البروتوبلاست هو دمج خليتين من نباتات مختلفة مهضوم جدارهما بواسطة الإنزيمات للحصول على بروتوبلاست جديد يمثل المحتوى الوراثي للخليتين (الشكل التاليين). علماً بأن البروتوبلاست الأخير قد يكون غير ثابت وراثياً وأيضاً ليس بالضرورة تكشفه إلى كالوس ثم إلى نبات كامل. إلا أن هذه الطريقة قد فتحت الباب للحصول على أصناف جديدة وساعدت في الإسراع في برامج التربية لعديد من النباتات ويمكن إدراج هذه الطريقة ضمن طرق الوراثة الجزيئية molecular genetics والتي تتجنب استخدام التكاثر الجنسي التقليدي في نقل المادة الوراثية والحصول على تراكيب وراثية غير تقليدية.

نظرياً يمكن فصل البروتوبلاست لنباتات عديدة ومن أنسجة مختلفة ولكن يفضل الفصل من الأوراق الخضراء حديثة العمر لسهولة هضم جدر الخلايا التي تحتوي على طبقة رقيقة من الكيوتيكل بواسطة إنزيمات الهضم المتخصصة. كما يمكن الحصول أولاً على البروتوبلاست من الكالوس ثم إنشاء مزارع الخلايا في البيئة السائلة وهي تتميز بجدر رقيقة وفي مرحلة انقسام نشط في المزارع الحديثة.

يتطلب استخدام خليط من الإنزيمات أهمها السليوليز cellulase لتفكيك وتحليل الجدار الأولى للخلية وكذلك البكتينيز pectinaseلفصل الخلايا بعضها عن بعض ويمتاز استخدام الإنزيمات من المصادر الطبيعية عن استخدام الإنزيمات الصناعية (Kao and Michayluk، 1974)

 

عزل البروتوبلاست وزراعته

 

1 – اختيار الجزء النباتي (أوراق غضة – أو مزرعة خلايا معلقة ويفضل نباتات جيدة النمو – خالية من الأمراض – نامية في المعمل أو الصوبة.

2 – تعقيم سطحي جيد للأوراق وإزالة طبقة البشرة من الأوراق.

3 – فصل البروتوبلاست من خلايا الميزوفيل آو من معلق الخلايا باستخدام إنزيمات هضم الجدار الخلوي مع ضب الاسموزية (700-800 ملليموز).

4 – تنقية البروتوبلاست خلال مناخل دقيقة (60-80 ميكروميتر) للتخلص من بقايا الخلايا.

5 – تعليق خلايا البروتوبلاست في محلول البيئة المغذية.

6 – تحضين خلايا البروتوبلاست.

7 – اعاده تكوين الجدار حول البروتوبلاست.

8 – حدوث الانقسام الخلوي الأول.

9 – استمرار الانقسام لإنتاج نوية من الخلايا المتماثلة colony

يوفر البروتوبلاست مدخلاً جيداً لدراسة العلاقة بين العائل والفيروس الذي يصيبه وقد طبقت هذه الطرق في دراسة عديد من الفيروسات النباتية باستخدام بروتوبلاست من ميزوفيل الورقة وقد أدى تطور إنماء وحفظ البروتوبلاست إلى تطور وفهم مواز لهذه الدراسات Aoki and Takebe، 1969; Asselles and Cocker، 1980 and. Davey et al.، 2005

إن مجرد إزالة جدار الخلية للحصول على البروتوبلاست فتحت المجال لمزيد من تطبيقات التداول المعملي للخلايا النباتية ويجب أن نذكر أن برامج التربية التقليدية التي تعتمد على تعريض النباتات للظروف غير الملائمة مثل الملوحة العالية أو التعرض لسمية العناصر الثقيلة بالتربة ثم الانتقاء لما هو متحمل لهذه الظروف، ومن المعروف أن هذا العمل يحتاج إلى فترة زمنية طويلة فضلا عن عمل مضن وتكاليف عالية للوصول إلى النتائج المرجوة ولكن باستخدام الخلايا المفردة أو البروتوبلاست يسمح بانتقاء ملايين الخلايا في حيز صغير ووقت قصير نسبياً ويمكن لهذه الخلايا أن تتكشف إلى نباتات كاملة وتختبر للمقاومة بعد ذلك على مستوى النبات حتى يتم التأكد من ثبات الصفة المكتسبة.

أشار 1983. Dodds إلى تطبيقات البروتوبلاست في مجال إنتاج أشجار الفاكهة حيث يتم عزل البروتوبلاست ثم عمل دمج بين بروتوبلاست أصناف فاكهة مختلفة للحصول على هجن جديد بين سلالات غير متوافقة جنسيا ولا يمكن تلقيحها وهذا يخدم بشدة برامج تربيه الفاكهة وتحسينها علي المدي الطويل.

 

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.

 

عن marwa reda

شاهد أيضاً

طرق الاكثار المستخدمة فى مشاتل الاشجار الخشبية

الشبكة المعلوماتية للتنمية زراعية أ- التكاثر البذري( التكاثر الجنسي):   التكاثر البذري هو إنتاج فرد …

اترك تعليقاً

لن يتم نشر عنوان بريدك الإلكتروني. الحقول الإلزامية مشار إليها بـ *